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PCR技术推动分子病毒检验

发布时间 | 2021-01-06


PCR技术推动分子病毒检验



对于病毒学的研究,由来已久,如果从检验的角度去追溯这段历史,那绕不开的一个重大的节点,在60多年前通过细胞培养方式来分离病毒,而临床微生物室也因此将病毒和衣原体纳入常规诊断。


但作为许多病毒感染的恢复和鉴别诊断标准,体外培养诊断的作用有限,且缺乏标准化。而且商品化细胞系会随着传代次数和传代方法的不同而变化,观察细胞病变也带有主观性,体外细胞感染病毒敏感性范围也有限。
例如,尽管HSV在多种细胞中能有效复制,但重要的人类病原体,如HIV、肝炎病毒和EBV等,仍然不能在临床实验室采用细胞培养技术进行常规检测。
80年代后,衣原体的细胞培养法逐渐被核酸杂交和扩增技术所取代,美国CDC推荐使用全自动的分子方法诊断衣原体,衣原体诊断方法的改变预示着未来病毒诊断实验室的应用技术也将发生改变。

PCR技术得到快速的发展,比如各种自动化仪器的开发、快速热循环和目的核苷酸序列的标准化荧光定量检测等,PCR技术的应用使得病毒的实验室检测往前了一大步,人类终于解决了医学上最重要病原体的实验室诊断问题。

HSV的检测奠定PCR金标准的地位

HSV是中枢神经系统疾病最常见的病因,约占这类疾病的2-19%,如果没有及时和正确的抗病毒治疗,病死率高达70%。HSV是众多临床实验室最常检测到的病毒。
然而却很少从脑脊液中分离出来,过去认为接种尸解脑组织分离病毒是实验室诊断HSV引起中枢神经系统疾病的金标准,然而这方法在实际的应用中非常不现实!
1990年,Rowley等首先使用PCR方法检测中枢神经系统疾病病人CSF样品中的HSV DNA,研究表明使用PCR的方法能够获得和脑组织培养相同的敏感度,时间上却大大缩减了。

对于脑脊液标本,很少能够分离培养到病毒,但使用PCR方法之后有效诊断了带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)等,因此,和HSV一样,PCR也逐渐成为这些病毒检测的金标准方法。

HIV和HCV奠定PCR全自动发展方向

HIV和丙型肝炎HCV检测为分子检测纳入传统诊断病毒实验室提供了一个非常好的样板。
1983年HIV被证明是艾滋病的致病因子,但是对于HIV RNA的检测却一直都没有良好的质量控制方法,因此在检测过程中严格控制采样、提取、扩增和检测等各种可变因素,就变得格外的迫切。
HIV和HCV病毒因为其本身的特殊性,其检测背后隐藏着疾病预后、确定抗病毒治疗初始时间、检测治疗方案的效果等等诸多的临床需求。
HIV 的依赖RNA的DNA多聚酶(逆转录酶)纠错能力极低,导致其经常发生突变,易产生耐药性等;与此相似的是HCV病毒可分为6个主要的基因型,基因型还可以再分亚型,不同的基因型治疗效果也有差异。
临床需求推动检验技术的发展, Visible Genetics公司开发了第一个由FDA批准的商品化系统,能对HIV-1进行基因分型,这款系统具有检测和结果解释的双重功能。
自此对于扩增和序列分析的自动化需求和商品化形态匹配完成,交给时间的就是后续不断的迭代进化发展了。

荧光PCR的“划时代”出现

PCR技术从基于凝胶电泳和微孔板检测到快速荧光定量PCR检测是一个巨大的突破,而该技术在传染病诊断方面应用的越来越广泛,商品化的国际荧光定量PCR系统有ABI系列、罗氏480、CFX-96及GeneXpert系统等等,国内的有SLAN系统、博日、雅睿、达安等。
有趣的是,分子微生物诊断中许多与荧光定量PCR应用有关的经验都来自LightCycler,其在1999年投入市场,荧光定量PCR系统的入局,也将从以下三个方面提升了诊断领域的PCR应用:
(1)快速循环扩增模式
(2)封闭的循环和检测系统显著减少了扩增产物的污染
(3)分析判定基因型和株差异,并可以保证结果的可靠性
实时荧光PCR设备和技术能够进行5-10个拷贝的核酸定性和定量分析,进行定量分析时,一个已知的目标核酸浓度作为标准系列要与病人的标本同时检测。
30年前,病毒核酸序列的PCR扩增和检测就被认为是诊断病毒学新时代的开始,然而除了商品化试剂盒外,只有极少数临床病毒学实验室使用分子诊断方法,经验告诉使用者,PCR扩增产物造成的污染问题极容易导致假阳性。
而自动化系统和荧光定量PCR技术的出现,很好的解决了这个问题,未来分子病毒学将朝着灵敏度更高、自动化程度更高的方向发展。